Gezwickt CRISPR in Neuronen gibt Wissenschaftler neue Kraft zu untersuchen, die Erkrankungen des Gehirns

Ein team von Wissenschaftlern an der UC San Francisco und dem National Institutes of Health haben einen weiteren CRISPR ersten, die möglicherweise grundlegend verändern, wie Wissenschaftler studieren Erkrankungen des Gehirns.

In einem Papier veröffentlicht August 15 in der Zeitschrift Neuron, die Forscher beschreiben ein Verfahren, dass verwendet eine spezielle version von CRISPR entwickelt an der UCSF, um systematisch verändern die Aktivität der Gene in menschlichen Neuronen generiert aus den Stammzellen, die erste gelungene Fusion von Stammzellen-abgeleiteten Zelltypen und CRISPR-screening-Technologien.

Obwohl Mutationen und andere genetische Varianten bekannt sind assoziiert mit einem erhöhten Risiko für viele neurologische Krankheiten, technologische Engpässe haben, konterkariert die Bemühungen der Wissenschaftler arbeitet, um zu verstehen, wie genau diese Gene, die Krankheiten verursachen.

„Vor dieser Studie gab es erhebliche Einschränkungen eingeschränkt, was Wissenschaftler tun könnte, mit menschlichen Neuronen im Labor“, sagte Martin Kampmann, Ph. D., associate professor in der UCSF Institut für Neurodegenerative Erkrankungen, eine CZ Biohub Investigator und co-senior-Autor der neuen Studie.

Für eine Sache, bis vor kurzem gab es keine Möglichkeit für Wissenschaftler, die zuverlässig erhalten menschliche Gehirn Zellen, die verwendet werden könnte in der erweiterten Labor-Experimenten, erklärt Kampmann, der auch Mitglied der UCSF-Weill-Institut für Neurowissenschaften. „Es war möglich, Neuronen, gespendet von Patienten, die hatten sich Verfahren, bei denen das entfernen von Hirngewebe zur Behandlung von Epilepsie oder Hirntumoren. Aber diese Beispiele können nur überleben, für ein paar Tage. Man kann nicht Experimente durchführen, um die Sonde gen-Funktion auf kurzlebige Neuronen.“

Stattdessen haben die Wissenschaftler in der Regel stützte sich auf Tiermodellen der Erkrankung des Gehirns, die nicht erfasst viele Nuancen der menschlichen Neurobiologie.

Der Durchbruch kam 2006, als Shinya Yamanaka, MD, Ph. D., der Universität von Kyoto und der UCSF-angeschlossenen Gladstone Institute, entdeckte einen Weg, um Rücklauf der Entwicklungs-Uhr und schalten Sie die adulten Zellen in Stammzellen könnten, mit einigen Zureden, verwandelt sich in jede Art von Zelle im Körper gefunden, einschließlich Neuronen. Diese „induzierten pluripotenten Stammzellen“ (iPSCs) aus menschlichen Gehirnzellen weithin verfügbar für Labor-Forschung.

Wenn die CRISPR-gen-editing-system, kam sechs Jahre später dachten die Wissenschaftler, dass hatten Sie endlich alle Werkzeuge, die Sie brauchen würde, um zu manipulieren Gene, die in menschlichen Neuronen und bestimmen, wie Sie tragen zu einer neurologischen Erkrankung.

Aber die Wissenschaftler schnell heraus, dass die DNA-Schneide-Maschinen des CRISPR-system, ein Enzym, bekannt als Cas9, nicht gut mischen mit iPSCs. „Stammzellen haben eine sehr aktive DNA-Schadens-Antwort. Wenn Cas9 produziert sogar nur ein oder zwei DNA schneidet, kann es zu Toxizität, die bewirkt, dass die Zellen sterben,“ Kampmann sagte,.

So Kampmann entschied sich gegen die Vergiftung. Als postdoc im Labor von UCSF-Professor Jonathan Weissman, Ph. D., Kampmann co-ein tool erfunden, bekannt als CRISPRi (für „Störungen“), eine modifizierte form der CRISPR Technologie, in der das Cas9-Enzym deaktiviert wurde. Wenn CRISPRi findet die gen, die es sucht, es unterdrückt seine Aktivität, ohne irgendwelche Schnitte. Als Ergebnis, im Gegensatz zu standard-CRISPR-Cas9, Kampmann vorhergesagt, CRISPRi sollte nicht giftig sein, um iPSCs oder Stammzell-abgeleiteten Neuronen.

In dem neuen Papier, Kampmann und seine Mitarbeiter beschreiben, wie Sie angepasst CRISPRi für die Verwendung in der menschlichen iPSCs und iPSC-abgeleitete Neuronen, und festgestellt, dass es könnte einen gezielten Eingriff in Gene, ohne zu töten die Zelle—ein Kunststück, das schon lange nicht Wissenschaftler.

Mit diesem system haben die Forscher gezeigt, wie Sie Ihre Technik kann verwendet werden, Gene zu finden, die möglicherweise verursachen oder dazu beitragen, die Erkrankungen des Gehirns. Zum Beispiel, Sie identifizierten Gene, die spezifisch verlängern die Lebensdauer von Neuronen, aber haben keine vergleichbare Wirkung auf die iPSCs oder Krebszellen. Sie fanden außerdem Gene, die erhöht die Anzahl der neurites—Projektionen, die wachsen von Nervenzellen und übertragen Nervenzellen Signale und bestimmt, wie oft Sie verzweigt.

Aber eines der überraschendsten Ergebnisse war die Feststellung, dass „housekeeping“ – Gene bekannt werden, die essentiell für das überleben, aber gedacht, um die gleiche Funktion in allen Zellen Verhalten sich tatsächlich anders in Neuronen und Stammzellen. Wenn die Forscher störten das gleiche housekeeping Gene in diesen zwei Zelltypen, die Zellen reagierten durch die Aktivierung (oder Inaktivierung) in einem völlig anderen Satz von Genen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass, im Gegensatz zu empfangen, Weisheit, housekeeping Gene kann nicht funktionieren auf die gleiche Art und Weise in verschiedenen Zelltypen, eine Idee, die Kampmann und sein Labor sind begierig, weiter zu erforschen, wie diese Unterschiede möglicherweise spielen wichtige Rollen in der Krankheit.

Kampmann ist nun die Verwendung der Technologie zur Untersuchung verschiedener Typen von Neuronen, in einer Anstrengung, um festzustellen, warum bestimmte Krankheiten selektiv beeinflussen, nur eine Teilmenge der Neuronen, die Art wie die motorischen Neuronen, die selektiv beschädigt ALS. Er erweitert auch seine Untersuchungen in anderen Arten von Gehirn-Zellen, einschließlich Zellen, den sogenannten Astrozyten und mikroglia—die Wissenschaftler erst vor kurzem herausgefunden, wie die Herstellung von menschlichen iPSCs.

Aber letztlich ist das Ziel, dieser Technologie, die verbindet CRISPRi und iPSCs in ein Werkzeug, das deckt die dringend benötigte neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von Erkrankungen des Gehirns.

„Eine der großen Herausforderungen für das Feld ist, dass für die meisten dieser Erkrankungen, die genauen molekularen Wege, die wir sollten gezielt für die Entwicklung von Medikamenten bleiben unklar“, sagte Michael Ward, MD, Ph. D., co-senior-Autor der neuen Studie und ein Arzt-Wissenschaftler an den National Institutes of Health.